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生命體是一個多層次，多功能的復雜結構體系，轉錄組代表了基因表達的中間狀態。基因功能的多組學分析過程中，實時定量PCR技術憑借其低廉的試驗成本，被廣泛應用于重要功能基因表達差異的驗證。研究人員僅需下載GenBank中目的基因的參照mRNA序列，設計、合成一對基因特異性擴增引物和一對適宜的看家基因擴增引物，抽提總RNA，反轉錄，進行實時定量PCR擴增，通過比較試驗組和對照組間基因表達的差異，就能確定試驗處理對功能基因表達的影響。但是貌似非常成熟的試驗體系真的能揭示特定功能基因轉錄組水平表達的真相嗎？研究人員是否遺漏了某些可能影響其研究結論的生物學事件？

可變剪接（alternative splicing，AS，又稱選擇性剪接，是真核生物基因表達的普遍調節機制, 指功能基因通過不同剪接，從一個mRNA前體（選擇不同的剪接位點組合）產生不同的mRNA剪接異構體的過程。可變剪接可產生在非翻譯區（UTR）或編碼序列，其機制包括: 外顯子跳躍（exon skip，ES）、內含子保留（retained intron，RI）、可變供體位點（Alternate Donor site，AD）、可變受體位點（Alternate acceptor site，AA）、可變啟動子（Alternate promoter，AP）、可變終止子（Alternate terminator，AT）和外顯子互斥（Mutually exclusive exons, ME）這七類。mRNA通過這七類可變剪接，對mRNA的穩定性、定位或翻譯進行調控[1]。90％~95％的人類基因會經歷選擇性剪接[2,3]。20,000種人類蛋白質編碼基因中有1/3以上的基因通過可變剪接產生多個蛋白亞型[4]。除了涉及器官發育，誘導細胞增殖、細胞分化，調節細胞類型特異性功能[5、6]外，可變剪接還與癌癥[7]、藥物靶點[8]等病理過程有關。

以磷酸酶和肌動蛋白調節因子1（PHACTR1）為例，2009年該基因就被確定與人冠狀動脈疾病（CAD）有關[9]。借助RACE和實時定量PCR技術，Valérie-Anne等（2018）確定該基因存在6種蛋白亞型，包括單核細胞表達435 bp的短轉錄本（144 aa），大腦表達1743 bp的長轉錄本（580 aa），和外顯子7、8或10、11可變剪接產生的A+(1953bp，650 aa)、B+(1674 bp，557 aa)、A-(1746 bp，581 aa)、B- (1467 bp，488 aa)4種適中長度的轉錄本。除短轉錄本與人免疫功能有關外，長轉錄本和冠狀動脈內皮或血管平滑肌細胞內表達的4種適中長度轉錄本均涉及CAD。PHACTR1內含子的rs9349379位點可破壞MEF2的結合位點，調節A+、B+的表達，zui終影響CAD[10]。

另外，馬的COBLL1基因存在COBLL1a和外顯子9缺失的COBLL1b這兩種可變剪接。COBLL1b缺失的外顯子9編碼40個氨基酸殘基，包含了酪蛋白激酶1、p38絲裂原活化蛋白激酶和蛋白激酶C的磷酸化位點，這些磷酸化位點與蛋白的穩定性密切相關。通過比較sai馬多個組織的COBLL1的表達發現，多個組織的COBLL1b表達較為穩定；腎臟、脊髓、肺中COBLL1a的表達量zui高，甲狀腺和結腸中表達zui低；純種馬運動后肌肉組織COBLL1a和COBLL1b的表達均發生下調。因此，COBLL1基因僅通過外顯子9的有無就實現了同一基因在不同組織表達模式的精細調控，并zui終影響賽ma運動后的肌肉葡萄糖水平的調節或能量來源轉換過程[11]。

以上兩個例子都說明了，通過可變剪接，同一基因可發揮不同的生物學功能。如果不了解目的基因的可變剪接情況，科研人員通過直接下載GanBank登錄的參照基因mRNA序列，就設計功能基因的定量檢測引物，來檢測基因的表達情況，獲得的很可能是不全面，甚至錯誤的信息。

對功能基因表達的正確分析，首先建立在研究人員對目的基因可變剪接的全面認識之上。首先，研究人員應該通過RACE技術或三代全長轉錄組測序技術，明確目的基因是否存在可變剪接。如果證實目的基因存在多種可變剪接后，應對不同可變剪接的序列進行比對和生物信息學分析，確認可變剪接的類型和不同可變剪接的特征區域，針對相應特征區域設計定量的檢測引物，才能正確獲取功能基因的表達情況。