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十一長假結束，小編正式回歸。zui近新聞也是目不暇接，前有國人屠呦呦獲諾貝爾生理學和醫學獎，后有AB教主的世紀婚禮。為了讓還在倒時差的各位親們能更好 的跟上時代的新步伐，小編特意整理了哥家9月 24日下午19:15 ~21:00由*技術專家帶來的“單克隆抗體藥物純化工藝探索與開發"精彩Q&A回顧。錯過的親們，讓我們一起再次感受知識的力量吧！

1干貨回答 讓您分分鐘了解抗體純化工藝

什么是反壓、壓力降？

答疑解惑

“了解基本名詞術語"

反壓是層析過程中，泵產生流速，流速作用層析柱產生的壓力。如下圖所示：

層析柱的反壓以及壓力降
圖為?KTA Avant 的壓力顯示

0.5MPa 為層析柱的反壓，壓力降為0.3MPa

層析柱產生反壓：主要是層析介質，層析柱的設計，層析柱篩板等。真正影響層析介質的為壓力降，壓力降高于層析介質的耐壓，層析介質會損壞。

層析填料入廠檢驗做哪些比較合適？

答疑解惑

“填料檢驗多重標準"

原料入廠GMP要求做檢測，合格才能進廠使用。一般有幾種方法：

審計供應商	做供應商審計是否復合ISO等要求，確認此供應商符合我項目要求，所以可以免檢。
自己檢測	此需要在工藝開發中做層析介質重要參數對產品質量的確定。（例如：層析介質的顆粒在XX-XXum時，產品的質量才能到達要求，并且供應商的產品不同批次 的顆粒有較大差別，所以確定顆粒為比檢項目）。對于這個問題，國外藥廠一般在工藝開發時，至少做3批不同批號的層析介質實驗以確定供應商出廠指標范圍內可 以滿足要求。

Protein A和Protein G兩種介質在純化抗體有何區別，結合位點各有幾個？

答疑解惑

“Protin A和G的區別結合位點"?

Protein G 的結合位點	Protein G與Ig G的Fc結合，同時也可以結合IgG CH1區域。此配基為 17KD， PI 4.1. 在全抗體或Fc融合蛋白的純化中由于Protein A 層析介質的載量高于Protein G，所以一般使用Protein A層析介質。
Protein A 的結合位點	與IgG結合的亞類主要是IgG1、IgG2和IgG4。
Protein A與抗體IgG 結合區域	Protein A與抗體IgG 結合有兩個區域,Fc 與Fab。主要與Fc的CH2,CH3 結合的是Protein A 的B，與Fab 結合位點是VH3

各環節中濃縮和換液采用膜包還是中空纖維，二者有什么區別？

答疑解惑

“用途區別"

中空纖維	中空纖維一般用于樣品中含有沉淀、渾濁、顆粒等，以及低剪切力的樣品
膜包	膜包用于樣品比較干凈的樣品

“在工藝中區別"

中空纖維	用于低剪切力的病毒濃縮；固液分離；澄清；以及包涵體復性等
膜包	用于緩沖液更換，濃縮等

2、速問速答小問題大門道，好知識速速來襲

層析除病毒驗證，

需要做舊膠的驗證嗎？

答疑解惑

關于病毒驗證是否需要做舊膠還沒有聽到法規的要求。新藥報批時一般要求工藝驗證，在工藝驗證中會涉及層析介質的壽命。層析介質壽命的確定是有效去除雜質達到質量要求。親和層析/離子交換介質已經有文章證明Protein A在壽命內有*病毒去除。

非糖基化的抗體

采用什么技術來去除？

答疑解惑

非糖基化的抗體一般是抗體片段(CHO表達的為有糖基)，抗體片段一般使用Protein L吸附Fab

陰離子交換低電導較好，但zui近做了DOE，

發現電導11比較好，何解？

答疑解惑

陰離子交換一般采用流穿模式（FT），所以需要一定的電導率讓抗體（單體）流穿，其他雜質吸附。不同的樣品還是以實驗為準

能否介紹一些FC-肽融合蛋白的精細純化方法？

答疑解惑

FC-融合蛋白的的精細純化一般采用陰/陽離子交換。也有使用HIC，或羥基磷灰石的純化。還要根據樣品做DOE。

柱高不變，直徑由1.6cm放大到比如20cm，柱壓會增大多少？

答疑解惑

層析放大的原理為直徑放大，柱高不變（即線性流速或保留時間不變）。在放大時層析柱的分配器，以及篩板設計非常重要。設計優異的柱壓一般不會增大。

工藝驗證中需要確定CQA，CPP，可以針對一個層析方法說明一下確認的方法嗎？

答疑解惑

首 先確定不同步驟主要去除雜質以及去除雜質能力，例如陽離子去除聚體步驟，經過此步驟聚體可以從2%降至0.3%。經過DOE實驗確定，CPP： 為上樣量（xx-xxmg/ml），樣品電導率（~~），洗脫時的電導率范圍。在以上的條件下可以滿足CQA（0.3%以下）聚體的要求。

陰離子流穿模式，說的載量指的是目的蛋白載量？VH一個domain的純化可以用Protein A親和嗎？

答疑解惑

陰離子流穿模式（FT）的載量指的是抗體的量。一般在上樣是抗體流穿，檢測純度，HCP等，至超標時上樣的抗體的量為載量

Protein A （重組的，非修飾的）與VH3結合

3、案例分享 ?用實驗中的真實案例答疑解惑

有沒有關于酸堿異構體組分降低的案例分享？

答疑解惑

對于酸堿異構體的分離一般比較困難，因為差異較小。在GE的應用文獻中有使用Capto S ImpAct分離的。一般使用陽離子交換（顆粒小的30-40um），做線性梯度洗脫。也可以在DOE時設計鹽梯度與改變pH同時的洗脫策略。

現在我做的抗體，proteinA 捕獲時只要載量高就會出現渾濁，低載量澄清？

答疑解惑

Protein A的層析介質	一般Protein A的層析介質載量在30-50g/l，洗脫時可以達到10-20mg/ml濃度，工程抗體的溶解度較高，一般較少出現沉淀。但是有時洗脫時由于HCP沒有去除干凈，洗脫液中會有沉淀，過夜或低pH后更明顯
建議	檢測抗體的溶解度，檢測洗脫的HCP的量
	此步驟可以使用低pH（pH在5-6，要實驗），加入一些鹽或低濃度尿素等

宿主DNA和宿主蛋白是否是同步去除的，宿主DNA如何更好去除？

答疑解惑

DNA/HCP一般會同步去除，只是不同步驟去除的量稍有不同。 對于DNA的去除，親和/陽離子交換/HIC不吸附，陰離子交換吸附。只有實驗才能確定您的項目哪種。

抗體的等電點能否用生物信息學的方法預測，消光系數怎么計算？

答疑解惑

一般預測的軟件得到的一些參數不是很準確，不同的表達系統，不同的培養方法，所得到的等電點不同。所以只能參考。

消光系數的公式	A=ECL，E消光系數，C濃度，L光徑。使用純的抗體樣品標定消光系數。
小技巧	使用1mlHitrap MabSelect Sure純化收集洗脫樣品，使用Lowry或Bradford標定消光系數。在之后的工藝探索中可以簡單的使用紫外吸收值定量。