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PCR引物設計八點決竅

（1）引物長度
        引物長度對反應特異性、解鏈溫度、退火時間都有較大的影響，zui終影響到 PCR 反應是否成功。多數情況下，引物長度約 18~30bp, 引物太短會導致非特異擴增，太長雖然會增加特異性，但是二級結構（如發夾結構）出現的概率增大。
（2）引物的解鏈溫度
        PCR 反應的特異性很大程度上依賴于引物的解鏈溫度（Tm 值）。多數 PCR 反應*的 解鏈溫度應在 55~60℃，如果沒有其他不穩定因素，引物的 Tm 值取決于它的長度、序列組成和濃度，離子強度的影響可以忽略不計，因為不同的 PCR 反應鹽濃度變化不大。
        一個反應中所有引物的解鏈溫度應盡可能接近。對于多數 PCR 反應而言，引物之間的差應小于 2~3℃。差值增大，反應效率會降低，甚至直接導致反應失敗。因為 Tm 值髙 的引物在低于退火溫度的條件下錯配，而 Tm 值低的引物在髙于退火溫度的條件下與模板只有低濃度結合。
        可利用以zui近鄰熱力學理論為基礎的公式估算 Tm 值，該理論分析了復式解鏈的熱力學過程。
Tm = [△H/△S-RIn(c)]-273.15（公式 1）
復式構成物中焓變（△H）和熵變（△S ）可借助于zui近鄰熱力學參數計算，為摩爾氣體常數，c 為寡核苷酸的物質的量濃度。該分析可確定特定的焓和熵對復式構成物的自由能 的影響，該影響由序列中的「zui近鄰」造成。zui近鄰從 5 末端起始，焓和熵的效應是加性的。在式（1）中加人另一個條件，以經驗性地計算鹽對復式構成物的穩定性的影響。