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上海雅吉生物科技有限公司

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高杰
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非標記抗體免疫電鏡實驗

2016-9-20 閱讀(239)

實驗方法原理    標記抗體法雖然具有許多優點,但也存在一些難以克服的問題,如標記抗體的分子增大,對細胞膜和組織的穿透力減弱;化學交聯反應對抗體和酶的活性有所影響;結合物中未標記的抗體可與抗原競爭結合,影響檢測方法的敏感性等。不標記抗體法可以避免上述的不利影響因素,通過一系統的非標記抗體的免疫學反應,對組織中的抗原進行定位檢測。不標記抗體法又可分為用標記物顯示和不同標記物顯示兩種方法。前者利用基因工程方法制備雙特異性抗體的F(ab′)2,一個Fab片段與標本中的抗原結合,一個Fab是抗體蛋白的結合片段。在抗體與標本作用后,再加入鐵蛋白與抗體結合,從而顯示組織內抗原的所在部位。后者則用磷酸鎢負染后,直接電鏡觀察。
實驗材料    病毒材料
試劑、試劑盒    抗體磷鎢酸瓊脂糖
儀器、耗材    高速離心機銅網Fomnvar膜透射電子顯微鏡離心管
實驗步驟    
一、材料及試劑
 
1.  待檢病毒材料  如糞便,氣管分泌物、腦脊髓液、組織培養液等。
 
2.  高速離心機
 
3.  已知抗體
 
4.  磷鎢酸
 
5.  瓊脂糖
 
6.  其它
 
二、操作方法
 
1.   將被檢病毒材料0.9 ml,加1︰5~1︰10稀釋的特異性免疫血清0.1 ml充分混合。
 
2.   置37℃作用1 h或37℃1 h后再置4℃。
 
3.   以17 000 r/min~23 000 r/min離心90 min。
 
4.   吸去上清,將離心管口倒置于濾紙上,吸去殘留液體。
 
5.   沉淀物中加少量H2O混懸,用3%磷鎢酸(pH6.0)負染20 s~30 s,滴加于400目銅網Fomnvar膜上,用濾紙從銅網邊緣輕輕吸去多余的負染液。
 
6.  在透射電鏡下4×104倍觀察。
 
三、結果判定
 
直接觀察病毒粒子的形態。由于離心濃縮的處理和特異性抗體的加入,大大提高了觀察的敏感性。



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