對大腦工作原理的解析離不開對神經元進行功能活動的記錄。神經元通過細胞膜電位的變化來編碼和傳遞信息，傳統電生理技術主要通過在大腦中插入不同形態和功能的電極來檢測神經元微弱的電信號，這些技術的發展在歷史上極大推動了神經科學的進步。近年來，結合功能熒光探針和光學成像的神經元功能光學成像技術在神經科學研究中引發了一場技術革命。與傳統電生理技術相比，光學功能成像技術具有通量高、非侵入和分子特異性高等優點。然而，由于直接對神經元膜電位進行功能光學成像面臨諸多技術挑戰，目前研究人員普遍選擇通過光學檢測神經元的胞內鈣離子濃度來間接獲得神經元的激活狀態。然而，這項技術缺乏解析單個動作電位的時間分辨率，也無法準確記錄神經元閾下膜電位的變化，在深入解析神經信號處理機制等方面存在不足。因此，開發能夠對神經元膜電位進行大規模光學記錄的新技術一直是神經科學研究的長期愿景和技術前沿。
 

　　相比于鈣離子成像，電壓成像的速度提升近100倍。不僅要求圖像采集速率提高100倍，還對在有限的熒光信號中高效捕捉微弱的電壓信號提出了極高的要求，給電壓敏感熒光探針和光學成像技術帶來了巨大的挑戰。目前，最高通量的電壓光學記錄主要通過寬場熒光顯微鏡對小鼠腦淺表神經元進行成像來實現，但其穿透深度小、效率低、通量有限等缺點限制了其在神經科學研究中的廣泛應用。
 

　　為了提高電壓成像的通量，并實現對三維神經網絡的同步成像，研究團隊開發了基于三維光場成像技術的電壓成像新方法。三維光場顯微鏡是一種高度并行化的成像技術，能夠在一次相機曝光中對三維體進行同時成像。王凱研究組長期致力于光場成像新技術的開發，并將其應用于神經科學研究：研究團隊曾發明拓展視場光場顯微鏡，首次實現自由行為斑馬魚的全腦神經元鈣離子功能成像(Cong et al., eLife 2017)；并進一步創新提出廣義共聚焦原理，發明共聚焦光場顯微成像技術，實現小鼠腦神經元和三維血管網絡循環血細胞的快速成像(Zhang et al., Nature Biotechnology 2021)。雖然光場成像的高速成像能力對電壓成像具有天然優勢，但仍面臨光效率低，速度與視場的矛盾，以及連續成像能力不足等問題。為此，研究團隊逐一攻克這些技術難題，首次實現大范圍神經元群體的三維電壓成像。
 

　　首先，光場成像需要一個高靈敏度、大靶面的相機來同時記錄多個視角的投影圖像。然而，由于相機的數據帶寬受限，大靶面相機的幀率無法滿足電壓成像的速度需求。為此，研究團隊提出通過降低采集圖像的動態范圍來換取更高的幀率。通常，電壓成像需要較高的動態范圍來捕捉高基線上微弱變化的信號。但研究團隊采用廣義共聚焦原理(Zhang et al., Nature Biotechnology 2021)，高選擇性濾除背景來降低信號基線，并有效整合多個視角的信息，實現了利用低動態范圍的相機來高效捕捉微弱的電壓信號。
 

　　進一步地，由于電壓成像信號微弱，極易淹沒在噪聲中。為了最大限度降低系統的噪聲，研究團隊系統性地研究了光場成像中的噪聲來源，發現激光光源的強度噪聲，掃描振鏡的同步噪聲以及動物血液流動導致的激光散斑噪聲都顯著降低了電壓成像的信噪比。為了克服這些難題，研究人員創新地提出基于單振鏡雙面掃描的共聚焦光場成像技術，結合高數值孔徑的光照明策略和新數據處理方法，有效將系統噪聲降低至泊松噪聲理論極限。
 

　　最后，為了最大化熒光信號的捕獲效率，實現長時程持續電壓成像，研究團隊優化了系統的光學效率。通過自主設計定制密集排列的微透鏡陣列，并最小化光學元件的數量，系統的通光效率比前期工作提高約3倍。
 

　　研究團隊將這些關鍵創新有機整合在新型共聚焦光場顯微鏡中，實現了對清醒小鼠腦三維視場中(直徑800微米，厚度180微米)數百個神經元的電壓信號開展同步記錄，并以每秒400幀的速度連續成像超過20分鐘。至此，新型共聚焦光場顯微鏡彌補了電壓成像在成像通量、信噪比與成像時長上的不足，極大地提升了電壓成像的應用范圍。為了驗證電壓成像獲取的信號真實可靠，研究團隊記錄了清醒小鼠初級視皮層中數百個神經元對光柵視覺刺激的反應特性。通過對神經元動作電位發放情況的統計，電壓成像成功鑒別出具有不同方向選擇性的神經元，且這些具有調諧特征的神經元占比與該區域已知的神經元特性相符。進一步，研究團隊對數百個神經元構成的三維神經網絡進行了功能連接分析。由于電壓成像能夠提供神經元的閾下膜電位信息，這一分析在傳統鈣離子成像和胞外電生理記錄實驗中無法實現。與膜片鉗記錄相比，電壓成像可在清醒動物中開展，且通量提高約100倍。分析表明，神經元之間同時存在興奮性和抑制性功能連接，并且在短距離內，抑制性連接強于興奮性連接。這種興奮-抑制的連接差異在三維空間上近似垂直于皮層表面的圓柱體。
 

　　總結而言，該研究開發了一種新型三維電壓成像新技術，大幅度提高了電壓成像的通量，使在清醒動物中進行三維神經網絡的功能聯接分析成為可能。這一關鍵技術進步為電壓成像技術的廣泛應用奠定了基礎，為神經科學研究提供了新的有力工具。
 

　　中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心(神經科學研究所)的博士后白璐和副研究員叢林為該研究的共同第一作者，穆宇研究員，徐寧龍研究員和熊志奇研究員參與指導了該項工作，王凱研究員為本論文的通訊作者。這項研究得到了科技部、國家自然科學基金委、中國科學院青促會、上海市及中國博士后科學基金的經費資助。
 

圖1 三維光場電壓成像顯微鏡示意圖和小鼠腦三維神經網絡電壓成像示例圖